エレクトロスピニングされたナノファイバーを使用したラット結腸へのストレプトマイシンの送達

Scientific Reports volume 12、記事番号: 21503 (2022) この記事を引用

821 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

薬物を担持した電界紡糸ナノファイバーは、共生微生物への影響を軽減しながら疾患治療を最適化できる可能性のある薬物担体システムです。溶媒として水を使用するグリーンエレクトロスピニング手順から製造されたストレプトマイシンを充填したプルランナノファイバーの実現可能性が評価されました。我々は、ストレプトマイシンを充填したナノファイバーで処理したグループ（STR-F、n = 5）、飲料水中の同様の濃度のストレプトマイシンで処理したグループ（STR-W、n = 5）、および非ナノファイバーを含むラット研究を実施しました。治療を受けた対照群 (CTR、n = 5)。ストレプトマイシンはナノファイバーに充填され、このビヒクルによって送達されることに成功し、腸の回腸区画に放出される薬剤の量が最小限に抑えられました。摂取されたストレプトマイシン耐性大腸菌は、最大 106 CFU/g 糞便で定着し、ナノファイバーベースの送達によって許容される低量で投与された場合でもストレプトマイシンの選択的効果が明らかになりました。土着微生物叢の 16S アンプリコン配列決定により、3 つのグループにおける異なる効果が明らかになりました。 STR-F 動物の盲腸におけるペプトストレプトコッカス科の増加は、ナノファイバーの発酵がこの科内の細菌の増殖を直接的または間接的に促進したことを示している可能性があります。我々の結果は、抗菌剤を大腸に送達するための新規媒体としてのエレクトロスピニングされたナノファイバーの関連特性を解明する。

抗生物質は感染症の制御と予防に重要ですが、腸内腔内の標的以外の細菌の侵入を妨げる可能性もあります1、2、3。抗菌療法の悪影響には、共生腸内細菌叢の破壊や薬剤耐性菌の発生が含まれます 3,4。

生体材料技術の開発により、ナノファイバーなどの高度な薬物担体が提供されており、これは治療薬の有効性に関する課題を克服し、抗菌薬耐性の発症リスクを軽減し 5,6 、腸内細菌叢への影響を最小限に抑えるのに役立つ可能性があります。

興味深いことに、ナノ構造担体による薬物送達は、細菌増殖の効率的な阻害や徐放などの関連する特徴を実証しています7。さらに、多糖類、特にプルランに基づく薬物送達システムは、非毒性、安定性、生体適合性、生分解性があるため、より注目を集めています8、9、10、11。シンプルで高速なナノファイバー形成システムであるエレクトロスピニングは、多層シート12、13、ナノハイブリッド14、15、コアシェルナノファイバー14、16などの新しい種類のナノ構造の作成を進めています。治療効果を向上させるために薬物放出挙動を操作するためのさまざまな潜在的なエレクトロスピニング戦略が最近検討されています 17,18。薬物送達用途における電界紡糸ナノファイバーの広範な使用に対抗して、いくつかの導入された電界紡糸ナノファイバーベースのシステムでは、製造手順に有機溶媒が含まれています6。ここでは、食品グレードのバイオポリマーとしてプルラン、溶媒として水を含むグリーンプロセスを使用しました。プルランは、真菌 Aureobasidium pullulans から生成される直鎖多糖であり、マルトトリオース型ユニット、つまり (1 → 4)-α-d-トリグルコシドとα-(1 → 6)-結合したもので構成されます19。この独特の結合パターンにより、プルラン20の高い接着力と引張強度が生まれます。他の多くの多糖類とは異なり、プルランは水素結合の程度が低いため、水に容易に溶解します。これは、フィルムや繊維を形成するための優れた加工可能性を提供し、非吸湿性の性質により、かなりの分子間機械的強度を示します8、19、21、22。さらに、この生体高分子は、非変異原性、非発がん性、生分解性、粘膜接着性、および細胞接着性の特性により、薬物送達用途に適した担体です6、9、13。

抗菌薬耐性は公衆衛生に対する世界的な最大の脅威の 1 つであり、現在私たちはポスト抗生物質時代の瀬戸際に立っている 23 ため、部位特異的な抗菌薬の送達が好まれます。抗生物質が効果を発揮する部位のみで抗生物質の局所濃度を高めるアプローチは、薬剤耐性の発生を軽減する方法となる可能性があります。したがって、この研究は、飲料水によるストレプトマイシン送達と比較して、摂取されたストレプトマイシンを負荷したプルランナノファイバーがラットの腸内細菌群集に及ぼす影響を説明することを目的としました。さらに、摂取された耐性菌株に対する選択的効果も評価されました。

カービー・バウアー法によって行われたディスク拡散アッセイにより、ストレプトマイシンの抗菌活性がエレクトロスピニングされた繊維に充填された後も残っていることが確認された。したがって、ストレプトマイシンを担持したナノファイバーは、感受性のある大腸菌および黄色ブドウ球菌株の増殖を阻害した(図1)。全体として、薬物のカプセル化は薬物の抗菌特性に影響を及ぼさなかったと結論付けています。したがって、エレクトロスピニングされたナノファイバーは、インビトロで抗菌薬の最適な治療レベルを維持するのに適していた。アモキシシリンを用いて行われた同様の研究では、ナノファイバー抗菌剤の埋め込みが薬剤の放出と活性を損なわないことが実証されています24。したがって、エレクトロスピニングされたナノファイバーは、薬物送達の分野におけるさまざまな用途に関連する可能性があります。

ディスク拡散アッセイ。（a）ストレプトマイシンを負荷したプルランの黄色ブドウ球菌ディスク拡散結果、および（b）ストレプトマイシンを負荷したプルランの大腸菌ディスク拡散結果。

ストレプトマイシン耐性大腸菌 MG1655-K12 の定着度に対するストレプトマイシン担持ナノファイバーの影響を調べるために、ラットの研究が行われました。接種前、これらの動物の糞便サンプルではストレプトマイシンまたはゲンタマイシンに対するバックグラウンド耐性は検出されませんでした（データは示されていません）。接種後 1 日目と 2 日目に、ナノファイバーにカプセル化されたストレプトマイシン (STR-F) または飲料水 (STR-W) を投与されたラットの糞便サンプルで、対照よりも有意に多くのストレプトマイシン耐性大腸菌が検出されました。 (CTR) グループ (図 2a)。 STR-FとSTR-Wの間に差は観察されませんでした（図2a）。 STR-W動物の盲腸サンプルではより多くの耐性大腸菌が見つかりましたが、STR-FグループとCTRの差は有意ではありませんでした（図2b、c）。 STR-W と STR-F の両方でストレプトマイシン処理が 2 日目に終了したためと考えられます。

CFU カウント。 (a) 1 日目、2 日目、および 3 日目の糞便物質 1 グラムあたりの大腸菌 CFU 数。 (b) 1 日目、2 日目、および 3 日目の盲腸内容物 1 グラムあたりの大腸菌 CFU 数。 (c) 1 日目、2 日目、および 3 日目の結腸内容物 1 グラムあたりの大腸菌 CFU 数。*(P < 0.05)。 **(P < 0.01); *** (P < 0.001)。 1 日目に CTR から得られたサンプルは 4 つだけでした。

飲料水中に 5 g/L として投与されるストレプトマイシンは、通性嫌気性細菌を抑制するために動物モデルで数十年間使用されており、それによって摂取されたストレプトマイシン耐性プロテオバクテリア種が定着障壁を克服できるようになります 25,26,27。現在の実験では、STR-F ラットにナノファイバーとして投与されるストレプトマイシン 7 mg の絶対量を一致させるために、STR-W ラットの飲料水にはるかに低い濃度 (0.25 g/L) を適用しました。それにもかかわらず、我々の結果は、現在適用されている基準よりも 20 倍低いこの濃度でも腸内での耐性菌の増殖を得ることが可能であることを示しています。

実験中の実際の水消費量を測定したところ、推定流出量の50％を考慮すると、STR-Wラットが消費したストレプトマイシンの総量は約12.5mgであることが明らかになった。上述のように、実験中にナノファイバーによってSTR-Fラットに投与されたストレプトマイシンは約7 mgでした。

腸内でナノファイバーから放出されたストレプトマイシンの濃度は、3 日目に得られたラットの腸内容物の ELISA によって評価されました。興味深いことに、STR-F グループの回腸サンプルでは、ストレプトマイシンの濃度が有意に (P < 0.005) 低いことが観察されました。 STR-Wグループとの比較（図3）。我々は、コーティングされたゼラチンカプセルが小腸で溶解し始め、粘膜付着特性を持つエレクトロスピニングされたプルラン繊維を放出すると推測しています9。その後、プルランナノファイバーが溶解してゼリー状の粘膜付着性構造を形成し、部分的に回腸を通って薬物を保持して大腸に移動し、そこでより多くの薬物が徐々に放出されます。

ストレプトマイシン濃度。回腸、盲腸、および結腸に存在するストレプトマイシンのおおよそのレベルを反映するヒートマップ。回腸サンプルでは STR-W および STR-F レベルが異なりますが (P < 0.005)、盲腸と結腸のレベルは 2 つのグループ間で異なりません。アッセイは 50 ng/mL 以上で飽和しました。図は、方法セクションで説明したように、GraphPas Prism で作成されました。

私たちの観察と一致して、同軸エレクトロスピニングによって生成されるコアシェルファイバーは、ストレプトマイシンなどの親水性薬物の持続放出に成功していることを以前に示しています28。プルランナノファイバーを使用した薬物送達用途に関しては、プルランの速溶解特性に焦点を当て、口腔経路を介した高速送達アプローチ8,19,29,30または創傷被覆材用途6,31にプルランを推奨するいくつかの研究がある。我々の発見は、抗生物質を充填したプルランナノファイバーは、溶解したプルランの粘膜付着特性により、大腸への送達にも適していることを示唆している。

腸内細菌叢に対するストレプトマイシン治療の効果を評価するために、16S rRNA 遺伝子アンプリコンの配列決定が行われました。微生物の豊富さは、CTR グループと比較して、STR-F (P = 0.008) および STR-W (P = 0.007) グループの糞便サンプルで有意に減少しました (図 4)。盲腸では、STR-F サンプルよりも CTR グループでわずかに高い濃厚さが観察されました。

盲腸、結腸、および糞便中の微生物の豊富さ。サンプルは点で示され、水平バーは平均を示します。 P 値は平均の順列検定から得られ、次のように示されます。 *(P < 0.05); **(P < 0.01); ***(P < 0.001)。

ベータ多様性は、ブレイとカーティスの非類似性に基づいてグループ間で比較され、ノンメトリック多次元尺度法 (NMDS) で視覚化されました。 3 つの異なるクラスターは、それぞれ STR-W、STR-F、および CTR サンプルを表しました（図 5a）。全体として、PERMANOVA モデルに基づくと、治療は腸内の位置よりも影響力が大きかった (0.27 [グループの R2] 対 0.09 [位置の R2]、P = 0、100 回の反復による順列検定)。各場所でのすべてのグループのペアワイズ比較は、2 つの STR 処理グループからの糞便サンプルを除いて、すべてのケースで有意でした (図 5b)。

盲腸、結腸、および糞便中の微生物組成。（ a ）ASVレベルでのサンプルの全体的な微生物組成は、Bray-Curtis距離を使用して評価され、非計量多次元尺度法（NMDS）で視覚化されました。 (b) ある場所でのグループ間のベータ多様性の比較を示す表と、Bray-Curtis 距離を使用して PERMANOVA モデルから P 値が導出されます。 (c) 最も豊富な門の上位 10 位の分類学的組成を示す棒プロット。

バクテロイデスとファーミクテスを合わせて、ラットサンプルで同定された ASV の 99% 以上を構成しました。盲腸、結腸、および糞便からのサンプル中のSTR-WおよびSTR-Fグループでは、ファーミクテス属の相対存在量の大幅な減少と、それに対応するバクテロイデス属の相対的な増加が見つかりました（図5c）。

家族レベルでは、STR-W および CTR の両方と比較して、STR-F 動物の盲腸ではより低いレベルの乳酸桿菌科が認められましたが (図 6)、ペプトストレプトコッカス科、特にロンブーシア属の豊富な量が見られました (図 6)。。ペプトストレプトコッカス科は健康なラットの共生生物であり 32、ペプトストレプトコッカス科に属するロンブーシアは、広範囲の炭水化物を利用するように適応した嫌気性微生物で構成され、タンパク質合成を外因性のアミノ酸とペプチドに依存しています 33。 STR-W グループよりも STR-F グループで観察されたこの種のより高いレベルは、結腸内でのナノファイバーの発酵によるものであり、これがこのファミリー内の細菌の増殖を直接的または間接的に促進すると推測しています。ナノファイバーの難消化部分は、α-1,6 結合で接続されたマルトトリオース単位で構成されており、哺乳動物の腸内酵素には耐性がありますが、大腸での細菌発酵には利用可能です 34。

グループ間の相対的な分類群存在量の比較を示すツリープロット。中心の最大のノードは細菌界です。外側へのツリーの枝に沿って、次のノードは門レベルであり、その後にクラス、目、科、属が続きます。ノードのサイズは、対応する系統レベルの平均相対存在量に比例します。ノードの相対存在量がグループ間で大きく異なる場合 (順列検定)、ノードにラベルが付けられ、色が付けられます。図は、「メソッド」セクションで説明したように R で作成されました。

ストレプトマイシンは、抗菌活性を失うことなくエレクトロスピニングされたナノファイバーに組み込むことができ、さらに、カプセル化されたナノファイバーと一緒に投与することにより、小腸を通って保持され、ラットの大腸に送達されることができます。我々の結果は、エレクトロスピニングされたナノファイバーが、大腸への抗菌剤の送達のための先進的な代替手段であることを示唆している。このアプローチにより、効果を発揮するために必要な抗生物質の量を減らすことが可能となり、それによって耐性が発現するリスクが軽減され、常在微生物叢の乱れが少なくなる可能性があります。実際、ナノファイバーによる送達は、飲料水による送達とは異なる方法で微生物叢に影響を与えることが見られました。

プルランは林原株式会社（日本）よりご提供いただきました。水は、18 MΩ・cm より高い抵抗率を備えた Milli-QPlus 185 浄水システム (Millipore、マサチューセッツ州ベッドフォード) を使用して精製されました。ストレプトマイシン標準ディスク (ディスクあたり 25 μg) はデンマークの Oxoid から購入しました。ヘキサメチルジシラザン (HMDS) は Merck (ドイツ) から入手しました。ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トレハロース、および RSM (脱脂粉乳) は、デンマークの Sigma-Aldrich から購入しました。

ストレプトマイシンを、それぞれ最終濃度１％および１０％（ｗ／ｗ；ポリマーの重量に対するストレプトマイシンの重量）でプルラン電界紡糸ナノファイバーに充填した。ストレプトマイシンをプルランにカプセル化するには、まずストレプトマイシン粉末を水に溶解し、次にプルラン粉末を溶液に加えて所望の濃度を達成しました。プルラン構築物に対して 1% または 10% ストレプトマイシン (w/w) を作成するには、まず、25 ℃ で 4 時間、わずかに撹拌しながら、0.2% または 2% (w/v) のストレプトマイシン水溶液を作成しました。次いで、プルラン粉末を添加して、プルランの２０％（ｗ／ｖ）水溶液を作製し、室温で一晩撹拌した。例えば、1% (w/w) ストレプトマイシン: プルランナノファイバーシートの作製には、25 ℃ で 4 時間、わずかに撹拌しながらストレプトマイシンを水に溶解しました (濃度 2 mg/mL)。次いで、プルラン粉末（０．２ｇ）を１ｍＬ溶液に添加して、最適なエレクトロスピニングのために水中２０％プルランの所望の最終濃度を作製した。最後に、溶液を 25 mm フィルター (Sigma Aldrich) を通して滅菌濾過し、エレクトロスピニングに使用しました。

エレクトロスピニングには、高電圧源 (Glassman、FJ50P2.4-F22)、21 G 皮下注射針を備えたシリンジに接続されたシリンジポンプ (Aladdin、AL-1000)、および静電気コレクターを含むカスタマイズされた従来のエレクトロスピニングシステムを使用しました。。最適化された紡糸パラメータは、供給速度 1 mL/h、電圧 14 ～ 16 kV、針先からコレクターまでの距離 15 cm、湿度 35%、温度 25 °C に設定されました。各エレクトロスピニング手順を開始する前に、ポンプとコレクターを含むエレクトロスピニングチャンバーを 70% EtOH で消毒しました。

エレクトロスピニング後にストレプトマイシンの抗菌活性の有効性が残っているかどうかを調べるために、カービー・バウアー法によるディスク拡散アッセイを実行しました35。ナノファイバーシートに充填されたストレプトマイシンの抗菌活性を、グラム陰性菌（大腸菌（E.coli）MG1655 亜株K12（ATCC 47076））およびグラム陽性菌（黄色ブドウ球菌（黄色ブドウ球菌）（ATCC 2928））に対して分析しました。ストレプトマイシン感受性細菌。大腸菌および黄色ブドウ球菌株を、Luria Bertani プレート (LB) 内で 37 °C で一晩増殖させました。各サンプルの接種材料を調製し、懸濁液の濁度を濃度計 (Sensittre-Nephelometer、Thermo Fisher、Denmark) で 0.5 マクファーランド標準と比較して調整しました。次に、100 マイクロリットルの接種材料をミュラー・ヒントン寒天プレート上に広げました。 10 μg および 100 μg (1 および 10% w/w ストレプトマイシン:プルランナノファイバーから) を含むエレクトロスピニングシートを 6 mm の生検パンチで切断し、同じ直径 (25 μg) の標準ストレプトマイシンディスクと並べて置きました。、デンマーク）を対照として使用した。ストレプトマイシンを含まないエレクトロスピニングシート（プルランナノファイバー）をネガティブコントロールとして含めました。サンプルを 35 °C で 16 ～ 18 時間インキュベートしました。阻害ゾーンの直径を測定し、EUCAST ガイドライン (https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_11.0_Breakpoint_Tables.pdf) によって提供される限界点の値と比較しました。

抗生物質を充填したナノファイバーをラットに投与するために、10%ストレプトマイシン:プルランの電界紡糸シートを手動で切断して、長さ約1 mmの正方形の粒子を作成しました。次に、硬殻ゼラチンカプセル（Torpac サイズ 9）を、オイドラギットに対して 5% w/w の比率で可塑剤としてセバシン酸ジブチルを添加した、オイドラギット L100 の IPA 12% (w/v) 溶液でコーティングしました。最後に、ラットに投与する前に、カプセルに 12 mg の粒子 (カプセルあたり 1.2 mg のストレプトマイシンに相当) を充填しました。

ストレプトマイシンを充填したナノファイバー電界紡糸シートが腸内でのストレプトマイシン耐性細菌の定着に影響を与えるかどうかを調べるために、ストレプトマイシン耐性 mCherry 標識大腸菌 MG1655 菌株を動物に経口接種するラット研究を実施しました。 K12、分類群識別子 511145 (https://www.uniprot.org/uniprot/A0A4D6FVK6) は、カプセル化されたナノファイバーとして飲料水に含まれるか、または対照としてストレプトマイシンなしで送達されるストレプトマイシンと併用されます (図 7)。蛍光標識株は、顕微鏡による検証を容易にするために選択されました。

研究概要。 in vivo 研究の概略図。プラセボの硬殻ゼラチンカプセルを受け取った CTR (対照)、オイドラギット 100S でコーティングされ、抗生物質を封入したプルラン粒子を封入したカプセルを受け取った STR-F (ストレプトマイシンを封入したナノファイバー) を表します。 STR-W（飲料水中のストレプトマイシン）には、プラセボの硬殻ゼラチンカプセルと飲料水中のストレプトマイシン（0.25 g/L）を投与しました。すべてのグループに 108 CFU のストレプトマイシン耐性大腸菌を単回投与しました。図は著者によって BioRender で作成されました。

15 匹の雄の 8 週齢 Sprague-Dawley ラット (Charles River) を 5 匹ずつ 3 つのグループに割り当て、スキャンテイナー (Scanbur) に個別に収容しました。 7日間の順応期間の後、動物は、飲料水中（STR-W）、エレクトロスピニングされたナノファイバーの粒子内部（STR-F）、または抗菌薬を投与されなかった（CTR）のいずれかでストレプトマイシンで治療されました。 CTR ラットにはプラセボの硬殻ゼラチンカプセルを投与し、STR-F ラットには上記のように抗生物質を充填したプルラン粒子を充填した硬殻ゼラチンカプセルを 3 日間 (0、1、2 日目) 1 日 2 回投与しました。 STR-W ラットには、同じ 3 日間、空のプラセボ硬殻ゼラチンカプセルと飲料水中のストレプトマイシン (0.25 g/L) が与えられました (図 7)。我々は、平均水消費量が約5mgであることを考慮すると、STR-Wラットによるストレプトマイシンの総摂取量がSTR-Fラットに投与された約7mgと一致するような飲料水中の濃度を目標とした。 1 動物あたり 1 日あたり 30 ～ 50 mL の水。この研究では、前述のように、ストレプトマイシンおよびゲンタマイシン耐性大腸菌を LB 寒天 (SSI Diagnostica A/S) 上で 16 時間インキュベートしました。コロニーを、20 μg/mL ゲンタマイシンおよび 100 μg/mL ストレプトマイシンを添加した LB ブロスに移し、振盪しながら 37 °C で一晩/16 時間培養しました。培養物を５０００×ｇで１０分間遠心分離し、洗浄し、細胞密度１０９ＣＦＵ／ｍＬになるまで滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。ストレプトマイシン治療の開始から 24 時間後に、すべてのグループに約 108 CFU のこの株を単回投与しました。実験全体を通じて、動物には自由に餌を与え、水を与えた。

接種前と接種後 24 時間、48 時間、および 72 時間後に糞便サンプル (約 1 g) を収集しました。 72 時間後、動物を CO2 窒息とそれに続く断頭によって安楽死させました。ラットを解剖し、回腸遠位部、盲腸、および結腸領域から管腔内容物を無菌的に収集した。これらのセクションからの内容物を秤量し、均質化した。 10倍希釈物を、必要に応じてストレプトマイシン（100μg/mL）またはゲンタマイシン（25μg/mL）（Sigma-Aldrich、デンマーク）を補充したLB寒天プレート上に広げた。 CFU 数は、嫌気条件下、37 °C で 24 ～ 72 時間インキュベートした後に評価されました。ランダムなコロニーを、Bruker Reflex™ III MALDI-TOF (Bruker-Daltonik、ドイツ) を使用した質量分析によって分析し、分離株が大腸菌 K-12 MG1655 に対応することを確認しました。

腸内腔に放出された薬物の量を推定するために、ELISA アッセイを実行して、糞便内容物中に存在するストレプトマイシンの濃度を確認しました。回腸、盲腸、結腸からの糞便ペレットを分析しました。サンプルをホモジナイズして希釈し、SM ストレプトマイシン ELISA キット (Elabscience, USA) (カタログ番号 E-FS-E031) の製造元の指示に従って手順を実行しました。光学密度 (OD) は、450 nm および 630 nm に設定したマイクロプレートリーダー Biotek EL800 (Agilent、DK) を使用して測定しました。データはGraphPad Prism Software 8.1.1を使用して処理されました。

DNA 抽出、ライブラリーの調製、およびその後の Ion Torrent プラットフォームでの配列決定は、前述のように実行されました 36。簡単に説明すると、サンプルは 72 時間の糞便サンプル (n = 15)、回腸からのサンプル (n = 15)、および結腸からのサンプル (n = 15) で構成されていました。 Qiagen の DNeasy® PowerLyzer® PowerSoil® 分離キットを使用して、約 0.2 g の材料を使用して微生物 DNA を抽出しました。抽出した DNA は、使用するまで -20 °C で保存しました。

16S rRNA 遺伝子の V3 領域の増幅は次のように実行されました。PCR マスターミックスは、0.2 μL Phusion High-Fidelity DNA ポリメラーゼ (ThermoFisher Scientific F-553L)、4 μL HF バッファー、0.4 μL dNTP (各塩基 10 mM) で構成されていました。 )、1 μM フォワードプライマー (PBU; 5’A-アダプター-TCAG-バーコード-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’) および 1 μM リバースプライマー (PBR; 5’-trP1-アダプター-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)、および 5 ng のコミュニティ糞便 DNA (総反応量 20 μL)音量。両方のプライマー (TAG Copenhagen A/S) はシーケンシングアダプターに連結されており、フォワードプライマーには各サンプルに固有の 10 bp バーコード (Ion Xpress™ バーコードアダプター) がさらに含まれていました。 PCR プログラムは、98 °C で 30 秒間の初期変性、その後 98 °C 15 秒および 72 °C 30 秒の 24 サイクル、最後に 72 °C 5 分間の最終伸長から構成され、その後冷却します。 4℃。各 PCR 実行にはテンプレートを含まないコントロールが含まれており、結果はすべて 0.05 ng/μL 未満でした。メーカーの推奨に従って、HighPrepTM PCR 磁気ビーズ (MAGBIO®、AC-60005) と 96 ウェルマグネットスタンド (MAGBIO®、MyMag 96) を使用して PCR 産物を精製しました。 Qubit® dsDNA HS アッセイ (InvitrogenTM、Q32851) を使用して DNA 量を測定し、200 bp の実行で Hi-Q ケミストリーを組み込んだ 318-Chip v2 を備えた Ion OneTouchTM および Ion PGM システムを使用してチップ上で配列決定しました。

生の配列はバーコードで逆多重化され、QIIME237 を使用してプライマーが除去されました。得られた配列をさらにフィルタリングして、125 ～ 180 bp の範囲にしました。これらの前処理された読み取りは、Ion Torrent に推奨されるパラメーターを使用して、R38 の DADA2 パイプラインで分析されました。その後、取得したアンプリコン配列バリアント (ASV) に、リボソームデータベースプロジェクト (RDP) データベース (リリース 11.5) を使用して分類学的に注釈を付けました。

統計分析は、QIIME2、R、および GraphPad Prism ソフトウェア 8.1.1 を使用して実行されました。リッチネスを計算する前に、サンプルは読み取りの深さが均等になるまで希薄化されました。 CFU 数、ストレプトマイシン濃度、微生物の豊富さ、分類群の存在量を両側順列検定で比較しました。相対存在量が 0.01% 未満の ASV (アンプリコン配列変異体) は、さらなる分析の前に除去されました。ベータ多様性は、Bray-Curtis 距離行列に基づいて評価され、順列多変量分散分析 (PERMANOVA) と比較されました。ツリーで示された分類学的構成は、R パッケージ「metacoder」39 を使用して生成されました。有意水準は 0.5 に設定されました。 STR-F動物とSTR-W動物の盲腸におけるELISAで評価されたストレプトマイシンレベルの比較は、等しい分散を仮定したt検定によって行われた。

デンマーク動物実験監督局は、ライセンス番号 2020-15-0201-00484 で動物実験を承認しました。実験プロトコルは DTU の BioFacility によって事前に登録されました。実験中、動物は毎日監視され、実験はデンマークの国家ガイドラインに従って実施され、動物の管理と使用については同研究所の動物福祉委員会の監督下で行われた。方法は ARRIVE ガイドラインに従って報告されます。

配列データは、番号 PRJNA758361 で NCBI Sequence Read Archive に寄託されています。

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この研究は、ノボノルディスク財団 (NNF17OC0026910)、MIMIO – 微細構造、微生物叢、および経口送達、およびデンマーク国立研究財団 (DNRF122) およびヴィラム財団 (助成金番号 9301)、マイクロコンテナを使用したインテリジェントドラッグデリバリーおよびセンシングセンターから資金提供を受けました。およびナノメカニクス (IDUN)。著者らは、動物を扱ってくれた DTU BioF の動物管理者に感謝の意を表します。

これらの著者は同様に貢献しました: Priscila R. Guerra と Fatemeh Ajalloueian。

デンマーク工科大学国立食品研究所、2800、kg。リンビー、デンマーク

プリシラ・R・ゲラ、シャオドン・ウェイ、カチャ・アン・クリステンセン、マーティン・イアン・バール、タイン・ラスク・リヒト

デンマーク工科大学健康技術学部、2800、Kgs。リンビー、デンマーク

ファテメ・アジャルイアン & アンジャ・ボイセン

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PRG と FA は、研究デザイン、ナノファイバーの調製、in vivo 研究、データ分析、および原稿の準備に貢献しました。 KAK は、in vivo 研究、ELISA、および配列決定の準備に貢献しました。 SW はデータ分析と原稿の作成に貢献しました。 MIB、AB、および TRL は、研究デザイン、データ分析、および原稿の準備に貢献しました。著者全員が原稿を確認し、承認しました。

タイネ・ラスク・リヒトへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Guerra、PR、Ajalloueian、F.、Wei、S. 他エレクトロスピニングされたナノファイバーの使用によるラット結腸へのストレプトマイシンの送達。 Sci Rep 12、21503 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-25769-z

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受信日: 2022 年 8 月 18 日

受理日: 2022 年 12 月 5 日

公開日: 2022 年 12 月 13 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25769-z

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エレクトロスピニングされたナノファイバーを使用したラット結腸へのストレプトマイシンの送達